Isolation, Charakterisierung, Differenzierung und Kryokonservierung adulter Stammzellen aus der Haut am Modell Sus scrofa domestica - Naturwissenschaftliche und juristische Implikationen zum Betrieb einer Genbank als Beitrag zur Sicherung der genetischen Diversität. ; Isolation, characterisation, di...
Die vorliegende Arbeit untersucht zwei grundlegende Fragestellungen im Hinblick auf den Betrieb von Genbanken als Beitrag zur Sicherung der genetischen Diversität. Das erste Kapitel behandelt aus rechtlicher Sicht die juristischen Fragen nach dem Zugang zu genetischen Ressourcen, nach dem Ausgleich aus der Nutzung entstehender Vorteile (Access and Benefit Sharing, ABS) und nach den Möglichkeiten des Handels mit Proben gefährdeter Tierarten, dies sowohl im Hinblick auf die rein wissenschaftliche Forschung als auch in Bezug auf kommerziell orientierte Zwecke. Grundlegend für die Bearbeitung dieser Fragen war die detaillierte Betrachtung des Übereinkommens über die biologische Vielfalt (CBD) und des Übereinkommens über den internationalen Handel mit gefährdeten Arten freilebender Tiere und Pflanzen (CITES). Da das CBD im Hinblick auf den Zugang zu genetischen Ressourcen in der Bundesrepublik Deutschland bisher nicht umgesetzt ist, bleibt dem Betreiber einer Genbank zur rechtlichen Absicherung und Klarheit nur die Aushandlung von Materialübertragungsverträgen mit den Ursprungsländern der genetischen Ressourcen. Der nachfolgende Handel mit gelagerten Proben gefährdeter Tierarten ist möglich, wenn dies nicht-kommerziell zur wissenschaftlichen Forschung erfolgt und die beteiligten Institutionen bei ihren Regierungen als wissenschaftliche Institutionen registriert sind. Bei kommerziellen Absichten unterliegt der Handel streng den durch das CITES vorgegebenen Regulierungen. Ausnahmen des Handelsverbotes sind möglich, z.B. dann wenn es sich um Proben von Tieren handelt, die in Gefangenschaft gezüchtet worden sind. Das zweite Kapitel behandelt aus naturwissenschaftlicher Sicht die Möglichkeit der direkten Gewinnung genetischer Materialien von Tieren. Hierbei wurde die Isolierung adulter Stammzellen aus der Haut von Säugetieren als Zielzellen zur Lagerung in Genbanken fokussiert. Am Modellorganismus Hausschwein (Sus scrofa domestica) wurde eine Methode zur Isolation adulter stammzellähnlicher Zellen aus der Haut etabliert. Durch nachfolgende Laborversuche wurden die isolierten stammzellähnlichen Zellen (pSSCs, porcine skin derived stem cell-like cells) charakterisiert. Wie mesenchymale Stammzellen haben pSSCs eine fibroblasten-ähnliche Morphologie und exprimieren die Oberflächenproteine CD9, CD29, CD44 , CD105 und sehr gering CD90. Neben diesen konnte die Expression der stammzellasoziierten Gene Stat3, Oct3/4, Sox2, Nestin, Bcrp1/ABCG2 und Bmi1 nachgewiesen werden. Weitere Versuche zeigten die induzierte Differenzierung der pSSCs zu Zellen zweier embryonaler Keimblätter, dem Ektoderm (Neuronen, Astrozyten) und dem Mesoderm (glatte Muskelzellen und Adipozyten). Zur vollständigen Charakterisierung und gänzlichen Ermittlung des Differenzierungspotentials bedarf es allerdings weiterer Versuche, die wegen der Kostspieligkeit und einem erhöhten zeitlichen Aufwand hier nicht realisierbar waren. Die Expansion und die Kryokonservierung der pSSCs zeigten geringfügige Auswirkungen auf den Phänotyp und das Differenzierungspotential. In Bezug auf die Kryokonservierung konnte wegen der geringen Anzahl an Versuchen eine definitive Aussage über ihre Folgen nicht getroffen werden. Folglich bedarf es weiterer Untersuchungen zur Ermittlung der Auswirkungen der Kryokonservierung auf adulte Stammzellen, die aus der Haut gewonnen werden können. Durch ihre Lagerung in Genbanken eröffnen aus der Haut isolierbare Stammzellen neue Möglichkeiten für den Artenschutz, dies vor allem durch ihre Anwendbarkeit im Rahmen modernster Reproduktionsmethoden und als nahezu unendliche DNA-Quelle für phylogenetische Studien, die zum Populationsmanagement unerlässlich sind. Trotz der sich aus dieser Arbeit ergebenden neuen Fragen - im Hinblick auf den Zugang, die Gewinnung und auch die Lagerung genetischer Materialien gefährdeter Tierarten -, bleibt festzuhalten, dass Genbanken generell die Möglichkeit bieten, vitales, biologisches Material bereitzuhalten. Dies ist sowohl bedeutend für die Grundlagenforschung als auch für den Einsatz dieser Materialien zur Steigerung der Reproduktion gefährdeter Arten, letztlich mit dem Ziel, genetische Variationen zu erhalten, die anderenfalls verloren gehen würden. ; This thesis investigates two major aspects with respect to the operation of a genbank as a contribution to the conservation of genetic diversity. The first chapter deals with legal aspects that have to be considered regarding access to genetic resources and fair and equitable sharing of the benefits arising out of their utilization (Access and Benefit Sharing, ABS). Also the regulations that are relevant for the international trade with specimen of endangered species are discussed. This is done with regard to the use of genetic material for fundamental scientific research and also for commercial orientated research. To reveal this legal framework, it was necessary to survey the Convention on Biological Diversity (CBD) and the Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora (CITES). Since the CBD and the associated regulations regarding access to genetic resources are not included into the national law of the Federal Republic of Germany until now, the authority of a genbank has to negotiate material transfer agreements (MTAs) with the government of the country of origin of genetic resources to reach legal certainty and legal clarity. The subsequent trade of specimen of endangered animals stored in a genbank is possible if it- just for non-commercial purposes and for a pure fundamental scientific research. In addition, the involved institutions have to be registered as scientific institutions by the management authority of their state. With regard to the use of specimen from endangered species for commercial trade, the regulations of CITES have to be adhered strictly. The second chapter deals with the natural scientific possibilities to obtain genetic material from animals. For that purpose, adult stem cells from the skin of mammals are considered as target cells for the isolation and the subsequent cryopreservation in genbanks. To establish a method for the isolation of skin derived adult stem cells, here the pig (Sus scrofa domestica) was used as a model organism. The isolated cells (porcine skin derived stem cell-like cells; pSSCs) had a spindle-shaped morphology similar to mesenchymal stem cells (MSCs). pSSCs expressed the MSC related proteins CD9, CD29, CD44, CD105, and to a very low extent CD90. Furthermore, pSSCs expressed Sox2 and Oct3/4, both transcription factors essential to the pluripotent and self-renewing phenotypes of embryonic stem cells which recently gained attention due to their function in inducing pluripotent stem cells. The expression of the progenitor marker nestin, the somatic stem cell markers Bcrp1/ABCG2, Bmi1, and Stat3 was detected by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) in undifferentiated pSSCs. After neuronal differentiation cells with a characteristic morphology of neuronal and smooth muscle-like cells were present in the cultures. Subsequent immunochemistry and flow cytometry revealed the down-regulation of nestin and the up-regulation of the neuron specific protein beta-III-tubulin and the astrocyte marker GFAP. Also, alpha-SMA expressing cells increased during differentiation suggesting the neuro-muscular differentiation of these skin derived cells. pSSCs could also be induced to differentiate into adipocyte-like cells when cultured under specific conditions. Hence, pSSCs have the potential to differentiate into cells from two different germ lines, the ectoderm (neurons, astrocytes) and the mesoderm (smooth muscle cells, adipocytes). The long time cultivation and the cryopreservation had slightly negative effects regarding the phenotype and the differentiation potential of the pSSCs. Subsequent investigations with respect to the cryopreservation are necessary. The cryostorage of adult skin derived stem cells opens up new possibilities for the conservation of endangered species via its possible utilization in modern reproduction technologies and since the high proliferation potential of these cells guarantees an almost infinite source of DNA for phylogenetic investigations that are needed for the management of populations from endangered animals. Generally, although many new questions arise out of this thesis - with respect to the access to genetic materials from endangered animals, its isolation and long-term storage - genbanks provide the possibility to hold viable genetic material in store. This is of great importance for fundamental scientific research as well as for its use in modern reproduction technologies, finally with the aim to preserve genetic variations that would otherwise be lost.
